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The invention relates to a non-immunogenic composition containing factor VIII and a process for their preparation according to the claims. In the prior art processes for the Behandlungszentren Thrombophlebitis of high purity, virusinaktivier ter FVIII products from the blood plasma isolated from the people, be described. EP 0 beschreibt Trennmaterialien zur Fraktionierung von Biopolymeren, die bei der Affinitäts- oder Ionenaustauscher-Chromatographie verwendet werden können.

EP 0, describes separation media for fractionation of biopolymers which can be used in the affinity or ion exchange chromatography, Behandlungszentren Thrombophlebitis. EP describes the combination of the measures to chromatographic purification, Behandlungszentren Thrombophlebitis, a surfactant treatment of FVIII in an aqueous solution and a heat treatment of the factor VIII preparation in solid state.

The heat treatment is carried out with hot steam in the presence of methanol or ethanol to provide certain proportions.

US-Patent 5, beschreibt das Erhitzen von gefriergetrockneten Gerinnungskonzentraten zur Reduzierung der Infektiosität von Viren, falls vor handen. US Patent 5, describes the heating of the freeze-dried clotting concentrates to reduce the infectivity of viruses, if fitted. In der Zeitschrift "Hemophilia World ; Vol, Behandlungszentren Thrombophlebitis. In the magazine "World Hemophilia ; Vol. Aus dieser Publikation sind in Tabelle 1 Angaben über die Virusinaktivierungsver fahren, mit denen diese Produkte behandelt werden, entnommen und durch europäische Produkte und Hersteller ergänzt.

From this publication, Behandlungszentren Thrombophlebitis, take the Virusinaktivierungsver with which these products are treated, Behandlungszentren Thrombophlebitis, and then supplemented by European products and manufacturers in Table 1 specifications. Das wichtigste Ziel bei der Entwicklung dieser Produkte war die Verbesserung ihrer Sicherheit bezüglich der Virusübertragung.

The most important goal in the development of these products was to improve their safety with regard to the virus transmission. This was achieved by improving the donor screening and the use of new techniques for virus inactivation and purification of FVIII. The end of the 70s and 80s during the year were sinaktivierungsverfahren for FVIII concentrates developed two of the most important Viru. Behandlungszentren Thrombophlebitis andere Verfahren beschreibt die Verwendung von Alkylphosphaten.

The other method describes the use of alkyl phosphates. The HEAT zen of proteins in solutions in the presence of sugars was determined by the addition of Ca ion-containing salts extended EP 0 The treatment of FVIII-containing plasma fractions with a combination of an alkyl phosphate and a detergent is described in EP 0, This method has proven particularly effective in the inactivation of enveloped viruses Horowitz MS et al, Behandlungszentren Thrombophlebitis, Lancet,2: However, this virus inactivation Solvent-Detergent SD method is generally not able to inactivate viruses without lipid-containing viral envelope.

As in the manufacture of drugs from Behandlungszentren Thrombophlebitis from humans, the risk Behandlungszentren Thrombophlebitis transmission of infectious agents by screening of donor plasmas can not be excluded, that risk should be further reduced by the use of sinaktivierungsverfahren Viru. This hepatitis A cases had a phased plan German authorities to the effect Behandlungszentren Thrombophlebitis Ind ; Dieses Produkt war durch Chromatographie an Glas gereinigt worden und pasteurisiert.

This product was purified by chromatography on glass and pasteurized. Of 47 patients who were treated exclusively with this product, developed a high titre 4 Inhibi tor 40, Behandlungszentren Thrombophlebitis, 90, and Bethesda Units BU. Die Anwendung dieses Produktes wurde aufgrund dieser Befunde beendet, Behandlungszentren Thrombophlebitis.

The application of this product was stopped because of these findings. The effect of virus inactivation on the structure of proteins is one of the key issues, and in particular the problem of Inhibito ren, Behandlungszentren Thrombophlebitis. Da es das Ziel der Bemühungen der Reinigung des FVIII aus Plasma ist, diesen von den übrigen Plasmaproteinen Behandlungszentren Thrombophlebitis trennen, sollte die Verwendung von Plasmaproteinen als Stabilisatoren ver mieden werden, da hierdurch die vorhergehenden Bemühungen der Aufreinigung hinfällig werden.

Since it is the aim of the efforts of cleaning the FVIII from plasma to separate it from the other plasma proteins, the use of plasma proteins as stabilizers should be avoided ver because it makes the previous efforts of purification shall lapse. Accordingly, the hemophiliacs should just get the protein needed by him.

The purified FVIII from plasma consists of a mixture of polypeptides having molecular weights between 80 to kDa, mit Krampfadern in der Polizei a number of subunits of a series of heterodimers Kaufmann R.

Thus, the present invention has for its object to provide a new Ver drive to the purification and virus inactivation of factor VIII containing from starting materials, substantially without the use of stabilizers, and a non-immunogenic factor VIII composition prepared noted.

Diese Aufgabe wird durch die in den Ansprüchen gekennzeichnete Ausführungsform gelöst, Behandlungszentren Thrombophlebitis. This object is solved by the embodiment characterized in the claims, Behandlungszentren Thrombophlebitis. The inventive method for preparing a non-immunogenic counteract the highly purified FVIII concentrate from plasma by humans is produced using two different virus inactivation.

Hinzu kommen vorzugsweise virusabreichernde Schritte bei der Herstellung. Added are preferably virusabreichernde steps in the production, Behandlungszentren Thrombophlebitis. In cryoprecipitate virtually all plasma proteins are present, some in enriched form to plasma, in particular the FVIII and fibrinogen.

The FVIII inventively produced product does Behandlungszentren Thrombophlebitis affect immunogenic and is compared to the Ursache von Krampfadern der Hoden bei Männern plasma, Behandlungszentren Thrombophlebitis, for example by about 10 4 times, in particular by the use of chromatographic purification, enriched. The fibrinogen is present as a non-clottable fibrinogen, that is the Clauss fibrino genbestimmung gives a negative result Clauss A, Acta Haemat The methods that will be used for the production of FVIII concentrates and the inactivation or elimination in the blood plasma occurring viruses that may have an influence on the structure and biological activity of proteins.

A prerequisite of the applicability of FVIII products that they before they are used after the addition of the solvent - norma mally this is a Behandlungszentren Thrombophlebitis for clinical applications of water water for injection - to dissolve without residue. Denaturierte Proteine sind in Wasser im wesentlichen unlöslich. Denatured proteins are insoluble in water substantially. To check the effect of the manufacturing method according to the invention to the structure of the proteins a number of physical and biological tests was performed Kotitschke R et al, Hemostasis, In particular, the effect of heat treatment has been verified to the proteins under the conditions Behandlungszentren Thrombophlebitis the manufacturing process according to the invention, since the FVIII extremely storage-unstable and sensitive to the HEAT-is known to act.

A heat treatment of FVIII Behandlungszentren Thrombophlebitis a freeze-dried state without any appreciable loss of activity is also known for FVIII products, their specific activity after the production of the plasma is very low eg. From the data listed in the following Behandlung von dilatierten Krampfadern be seen that the heated and non-heated FVIII product in the review of the structure and activity Behandlungszentren Thrombophlebitis identical results Fig.

In order to display on this graph, Behandlungszentren Thrombophlebitis, the columns for the individual parameters in almost comparable size, the individual parameters have been multiplied with either 10 or divided by 10 degrees. The Cryogenic Heat A has a ratio of about 0. Ent scheidend bei Die Behandlung Volksheilmittel für Krampfadern an den Beinen Studie ist jedoch der Vergleich des Verhältnisses der erhitz ten und nicht-erhitzten Proben.

Diese ist für beide Produkte nahezu gleich und bestätigt damit den relativ geringen Aktivitätsverlust durch die Hitzebehandlung. This is almost the same for both products, confirming the relatively low loss of activity by the heat treatment.

The impact of the manufacturing process according to the invention on protein structure was determined by the molecular weight distribution and SDS-Polyacryla mid-gel electrophoresis PAGE checks.

Arighi et al, Thromb Behandlungszentren Thrombophlebitis. Die Anwendungsbeob achtung an sieben Behandlungszentren für Hämophilie A wurde begonnen. The Anwendungsbeob respectful seven treatment centers for hemophilia A has started 1,th 51 Patienten wurden in diese Anwendungsbeobachtung einbezogen, mit der längsten Beobachtungszeit von 27 Monaten.

Bei keinem der 51 Patienten ist ein Inhibitor aufgetreten. None of the 51 patients an inhibitor has occurred. Die Patienten wurden über einen Zeitraum von 4 bis 26 Monaten untersucht, die überwiegende Anzahl über einen Zeitraum von 12 Monaten. The patients were studied over a period of 4 to 26 months, the vast number over a period of 12 months. Die maximale Anzahl der kumulativen Behandlungstage betrug The maximum number of treatment days was Behandlungszentren Thrombophlebitis A cumulative day of treatment comprises the FVIII amount was used for the treatment of a bleeding episode.

Die "response", Behandlungszentren Thrombophlebitis, "in vivo recovery" und Halbwertszeit wurde mit dem FVIII 1-Stufen-Test und einem chromogenen Substrat an 16 Patienten bestimmt; The "response", "in vivo recovery" and half-life was determined using the FVIII 1-step test, and a chromogenic substrate on 16 patients ; vgl.

Biological half-life and in vivo recovery of 16 hemophilia A patients. The inventive process is illustrated by the following examples. Production of FVIII from plasma by the person who is not immunogenic after the substitution to patients. Nine parts of donor venous blood were added to one part of a 3. Das Blut wurde direkt nach der Blutentnahme zentrifugiert und in die in physiologischer Kochsalzlösung aufgeschlemmten Erythrozyten dem Spender reinfundiert Plasmapherese.

The blood was centrifuged immediately after blood sampling and in the aufgeschlemmten in physiological saline to the donor erythrocyte reinfused plasmapheresis, Behandlungszentren Thrombophlebitis. Das Plasma wurde Behandlungszentren Thrombophlebitis innerhalb von 18 Stunden eingefroren. The plasma was frozen at the latest within 18 hours. Die Plasmen von mehreren Spendern wurden gepoolt gemischt, Behandlungszentren Thrombophlebitis. The plasmas from several donors were pooled mixed.

Die Kälteausfällung Kryopräzipitat wurde in an sich bekannter Weise durch Zen trifugation gewonnen. The cryoprecipitate cryoprecipitate was obtained in a conventional manner by Zen trifugation. The pH of the suspension was adjusted under stirring with 0. Die Mischung wurde auf Zimmertemperatur erwärmt und für 30 Behandlungszentren Thrombophlebitis gerührt, Behandlungszentren Thrombophlebitis. The mixture was warmed to room temperature and stirred for 30 minutes.

The pH was adjusted by addition of Behandlungszentren Thrombophlebitis. Der Niederschlag wurde abzentrifugiert und verworfen. The precipitate was centrifuged off and discarded. The supernatant was used for virus inactivation with a mixture of tri n-butyl phosphate TNBP 0.

H 2 O gelöst. H 2 O dissolved. The column was washed before application of the protein solution with a buffer of pH 6. Die Extinktion des Säuleneluates wurde bei nm gemessen. The absorbance of the column eluate was measured at nm. The sterilized FVIII solution was applied to the equilibrated gel and washed with the equilibration buffer until the UV signal had reached the baseline. For removing accompanying proteins, the column was equilibrated with a buffer of increased ionic strength of NaCl 0.

The FVIII solution was sterilized by filtration and, Behandlungszentren Thrombophlebitis, 10 ml in the final containers glass bottles 20 ml bottled. The temperature was measured with the device "Data Trace Micro Pack" Behandlungszentren Thrombophlebitis. Direkt nach der Entnahme der Flaschen aus dem Autoklaven wurden sie in einen Kühlraum ca, Behandlungszentren Thrombophlebitis.

Die Aufarbeitung des Kryopräzipitates bis zur Ultrafiltration wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. The workup of the cryoprecipitate to the ultrafiltration was carried out in the same manner as in Example.


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